DIVHYDO

Diversité des hydrogénases et de leur réactivité à l'oxygène
Vers de nouvelles enzymes productrices d'hydrogène et résistantes à l'oxygène.

Programme National de Recherche sur les Bioénergies (PNRB) 2006

Coordinateur: Laurent Cournac, CEA de Cadarache

Le projet associe les laboratoires du CEA (Cadarache et Grenoble), du CNRS (Cadarache et Marseille) et l'IRD (Marseille).
Le projet a commencé en Décembre 2006 et a duré 36 mois. Il a bénéficié dans le cadre du PNRB d'une aide ANR de 587 706€ pour un coût global de l'ordre de 2 240 000€.

Identifier à partir de la biodiversité de nouvelles hydrogénases, sélectionner les plus résistantes à l’oxygène et comprendre leur réactivité

Plusieurs algues vertes et cyanobactéries sont capables de produire de l’hydrogène à partir d’énergie solaire. Cependant chez ces organismes la production d'H2 est transitoire en raison de la sensibilité des hydrogénases (enzymes synthétisant l’H2) à l'oxygène produit par la photosynthèse. La sensibilité des hydrogénases à l’oxygène constitue donc un obstacle à leur utilisation pour des bioprocédés de production d'H2. Cette sensibilité présente cependant une grande variabilité dans la nature.

L’objectif du projet est de mieux comprendre les bases moléculaires de la sensibilité à l’oxygène des hydrogénases, afin de permettre de la lever ou du moins de la diminuer. Nous nous basons pour cela sur l’étude d’enzymes naturellement résistantes à l’oxygène qui nous sont apportées par le criblage de la diversité du monde microbien.
Ces connaissances serviront à proposer des stratégies d'optimisation des hydrogénases pour des projets de production d’H2 par des organismes photosynthétiques. Des hydrogénases résistantes à l'oxygène et stabilisées pourraient également être utilisées pour produire de l’électricité dans des biopiles à combustibles.

Criblage de la biodiversité, caractérisation fonctionnelle et structurale des hydrogénases identifiées, applications

Nous nous sommes dotés de nouveaux dispositifs pour identifier, sélectionner et cultiver afin de les étudier de nouvelles souches bactériennes mésophiles et thermophiles possédant des hydrogénases. Plus de 1300 souches ont ainsi été criblées et plus de 150 répertoriées comme possédant une activité hydrogénase, purifiées en monoculture et conservées.
En parallèle, une analyse bioinformatique de génomes et métagénomes séquencés, a permis d'appréhender la diversité des gènes codant pour des hydrogénases, des éléments clés de leurs séquences, et de leur relation avec les milieux dont les organismes qui les portent sont issus. Les souches sélectionnées au cours du projet, issues des cribles ou identifiées sur la base de résultats antérieurs des partenaires, ont été produites en masse et leurs hydrogénases extraites et purifiées pour réaliser leur caractérisation sur les plans biochimique, spectroscopique et cristallographique en vue de mieux comprendre l’interaction de ces enzymes avec l'O2. Pour cela, des approches spectroscopiques et électrochimiques innovantes ont été développées.
Enfin, des mutagenèses dirigées d’hydrogénases de cyanobactéries ont été entreprises afin de tester dans quelle mesure les caractéristiques identifiées sont transposables à des organismes photoproducteurs d’H2.

Résultats majeurs

Les hydrogénases de bactéries du genre Enterobacter, particulièrement actives et présentant une tolérance à l’O2, ont été analysées, séquencées, et sont en cours de purification.
Les dispositifs de culture mis en place ont permis de produire et caractériser une souche thermophile (Hydrogenobacter hydrogenophilus) très résistante à l’O2.
Grâce aux méthodologies développées nous avons pu quantifier de manière tout à fait nouvelle les paramètres de la diffusion des gaz dans les hydrogénases et leur impact sur la réactivité à l’O2.
La mutagenèse de l’hydrogénase de la cyanobactérie Synechocystis PCC6803, réalisée sur la base de ces résultats, a montré une légère mais encourageante amélioration de sa tolérance.

Publications scientifiques et brevets

Une dizaine d’articles ont été publiés ou soumis. Par exemple, nous avons démontré que l’hydrogénase de Clostridium acetobutylicum était inhibée de manière lente et partiellement réversible par l’O2, fait nouveau parmi les enzymes à FeFe (Baffert et al. 2008).
La relation entre diffusion des gaz dans l’enzyme et tolérance à l’O2 a été étudiée sur l’enzyme à NiFe de Desulfovibrio fructosovorans (Leroux et al. 2008, Dementin et al. 2009, Liebgott et al. 2009), dans la continuité d’un brevet déposé en 2007.
Dans l’hydrogénase à NiFeSe de Desulfomicrobium baculatum, un nouveau mécanisme de tolérance à l’O2 durant la production d’H2 a été identifié (Parkin et al. 2008).

Illustration

structure du site actif d'une hydrogénase

Structure comparée du site actif de l’hydrogénase tolérante à l’oxygène de la bactérie Desulfomicrobium baculatum en état réduit (A) et en état oxydé (B) : l’interaction de l’oxygène (en rouge) avec le sélénium (Se) est une des clés des propriétés remarquables de l’enzyme.
Ce type d’information pourra servir à la conception de nouvelles hydrogénases résistantes à l’O2 au sein d’organismes photosynthétiques.